DNA-sekvensointi

DNA: n sekvensointi on prosessi, jossa määritellään tarkka järjestys nukleotidin DNA-molekyylin. Se sisältää mitä tahansa menetelmällä tai teknologialla, jota käytetään määrittää järjestyksen neljän adeniini, guaniini, sytosiini ja tymiini on DNA-juoste. Kynnyksellä Rapid DNA sekvensointi menetelmiä on nopeutettava huomattavasti biologisen ja lääketieteellisen tutkimuksen ja löytö.

Tieto DNA-sekvenssit on tullut välttämätön biologiseen perustutkimukseen, ja monilla sovellettava aloilla, kuten diagnostisia, bioteknologia, oikeuslääketieteen, virologian ja biologinen systematiikka. Nopea nopeus sekvensointi saavutettu moderneilla DNA sekvensointi teknologia on auttanut sekvensointi täydellinen DNA-sekvenssit, tai genomien lukuisia ja lajien elämän, mukaan lukien ihmisen genomin ja muiden täydellinen DNA-sekvenssit monien eläin-, kasvi- ja mikrobilajit .

Ensimmäinen DNA-sekvenssit saatiin 1970-luvun alussa, jonka akateemiset tutkijat käyttämällä työläitä menetelmiä, jotka perustuvat kaksiulotteinen kromatografialla. Kehityksen seuraaminen fluoresenssipohjaiset sekvensointimenetelmät automaattisten analyysi, DNA sekvensointi on helpompaa ja suuruusluokat nopeammin.

Käyttö sekvensointi

DNA: n sekvensointi voidaan käyttää määrittämään sekvenssin yksittäisten geenien, suurempi geneettiset alueet, koko kromosomit tai koko genomeja. Sekvensointi tarjoaa järjestys yksittäisten nukleotidin DNA tai RNA eristettiin soluista eläinten, kasvien, bakteerit, arkkien, tai mihin tahansa muusta lähteestä geneettisen informaation. Tämä on hyödyllinen:

  • Molekyylibiologian - opiskelu itse genomiin, miten proteiinit tehdään, mitä proteiineja tehdään, yksilöidään uusia geenejä ja yhdistyksille sairauksia ja fenotyyppejä, ja tunnistaa mahdolliset lääkekohteiden
  • Evoluutiobiologia - tutkii, miten eri organismit liittyvät ja miten ne ovat kehittyneet
  • Metagenomics - tunnistaminen lajeja esiintyy vesistö, jäteveden, lika, roskat suodattamaton ilmasta, tai moppi näytteitä organismien. Hyödyllisiä ekologian, epidemiologian, microbiome tutkimus ja muilla aloilla.

Vähemmän tarkkoja tietoja on tuotettu muilla kuin sekvensointitekniikoilla kuten DNA-sormenjälkien. Tämä tieto voi olla helpompi saada ja on hyödyllinen:

  • Havaitsemaan tunnettuja geenejä lääketieteellisiin tarkoituksiin
  • Oikeuslääketieteen tunnistaminen
  • Isyystutkimus

Neljä kanoninen emäkset

Kanoninen rakenne DNA on neljä keskusta: Tymiini, Adeniini sytosiini ja guaniini. DNA: n sekvensointi on määrittää fyysisen järjestyksen näiden emästen molekyyli DNA: ta. On kuitenkin olemassa monia muita emäksiä, jotka voivat olla läsnä molekyylissä. Joissakin virukset, sytosiini Korvataan hydroksimetyyli tai hydroksi metyyli glukoosi sytosiini. Nisäkkäiden DNA, variantti emäkset metyyliryhmillä tai fosfosulfaatti voidaan löytää. Riippuen sekvensointi tekniikka, erityisesti muutos voi olla tai ei ehkä havaita, esimerkiksi, 5mC yhteinen ihmisillä voidaan tai ei voida havaita.

Historia

Vaikka rakenne DNA perustettiin kaksoiskierre 1953, vuosikymmeniä kulkisi ennen DNA-fragmentteja voidaan luotettavasti analysoida niiden järjestys laboratoriossa. RNA sekvensointi oli yksi varhaisimmista muodoista nukleotidisekvensoinnilla. Virstanpylväs RNA sekvensointi on sekvenssi ensimmäisen täydellisen geenin ja täydellinen genomin bakteriofagin MS2, ja julkaistu Walter Fiers ja hänen työkaverinsa yliopistossa Gentin, vuonna 1972 ja 1976.

Ensimmäinen menetelmä määrittämiseksi DNA-sekvenssit mukana aluekohtaisia ​​alukkeenpidennysmenetelmiä strategiaa perustettu Ray Wu Cornellin yliopistossa vuonna 1970. DNA-polymeraasi katalyysi ja erityisiä nukleotidin merkintöjä, jotka molemmat näkyvästi nykyisessä sekvensointi järjestelmiä, käytettiin sekvensoimaan tarttuvien päiden Lambda faagi-DNA Vuosina 1970 ja 1973, Wu, R Padmanabhan ja työtovereiden osoitti, että tätä menetelmää voidaan käyttää määrittämään tahansa DNA-sekvenssi käyttämällä synteettisiä sijainti alukkeita. Frederick Sanger sitten hyväksyi alukepidennysmenetelmää kehittämisstrategiaa nopeampia DNA sekvensointi menetelmiä MRC Centre, Cambridge, Iso-Britannia ja julkaisi menetelmän "DNA sekvensointi ketju-päättyvän estäjät" vuonna 1977. Walter Gilbert ja Allan Maxam Harvardin myös kehittänyt sekvensointimenetelmät, joista yksi "DNA sekvensointi kemiallisella hajoamista". Vuonna 1973, Gilbert ja Maxam raportoitu sekvenssin 24 emäsparin menetelmällä tunnetaan vaeltava paikalla analyysi. Kehittyneiden sekvensointi apunaan samanaikainen kehittäminen DNA-tekniikalla, joka mahdollistaa DNA-näytteitä voidaan eristää muista lähteistä kuin viruksia.

Ensimmäinen täysi DNA-genomi on sekvensoitu oli bakteriofagi φX174 vuonna 1977. Medical Research Council tutkijat avannut täydellinen DNA-sekvenssi Epstein-Barrin virus vuonna 1984, todeta sitä 170000 emäsparin pitkä.

Ei-radioaktiivinen menetelmä siirtää DNA-molekyylit sekvensointi reaktioseosten päälle immobilisoivaa matriisiin elektroforeesin aikana kehittäneet Pohl ja työtovereiden 80-luvun alussa. Seuraaja kaupallistamisen DNA sekvensserin "Direct-Blotting-Elektroforeesilaitteet-System GATC 1500" mukaan GATC Biotech, joka intensiivisesti käytetty osana EU genomin-sekvensseriohjelmalla, täydellinen DNA-sekvenssi hiivalla kromosomi II. Leroy E. Hood laboratoriossa California Institute of Technology ilmoitti ensimmäinen puoliautomaattinen DNA-sekvensoinnin kone vuonna 1986. Tätä seurasi Applied Biosystems "markkinointi ensimmäinen täysin automatisoitu sekvensointi kone, ABI 370, vuonna 1987 ja Dupont Genesis 2000 joka käyttää uutta fluoresoiva merkintöjä tekniikka mahdollistaa kaikkien neljän dideoksinukleotidien voidaan tunnistaa yhdellä kaistalla. Vuoteen 1990, Yhdysvaltain National Institutes of Health oli alkanut laajamittainen sekvensointi tutkimukset Mycoplasma capricolum, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans, ja Saccharomyces cerevisiae hintaan US $ 0,75 euroa perusta. Samaan aikaan sekvensointi ihmisen cDNA-sekvenssien kutsutaan ilmenevän geenin osiksi alkoi Craig Venter laboratoriosta, yrittää kaapata koodaus osa ihmisen genomin. Vuonna 1995 Venter, Hamilton Smith, ja työtovereiden instituutin genomitutkimuksen julkaisi ensimmäisen täydellisen genomin vapaana elävää organismia, bakteerin Haemophilus influenzae. Pyöreä kromosomi sisältää 1.830.137 perustaa ja se on julkaistu Science-lehdessä oli ensimmäinen julkaistu kokonaisten-genomin haulikko sekvensointi, poistaa tarpeen alkuperäisen kartoitus ponnisteluja. Vuoteen 2001, haulikko sekvensointi menetelmiä oli käytetty tuottamaan luonnos sekvenssi ihmisen genomin.

Useita uusia menetelmiä DNA sekvensointi kehitettiin 1990-luvun jälkipuoliskolla. Nämä tekniikat käsittävät ensimmäisen "seuraavan sukupolven" sekvensointimenetelmät. Vuonna 1996 Pål Nyrén ja hänen opiskelija Mostafa Ronaghi Royal Institute of Technology Tukholmassa julkaisseet menetelmän pyrosekvensointi. Vuotta myöhemmin Pascal Mayer ja Laurent Farinelli toimitettu patentteja Maailman henkisen omaisuuden järjestön kuvataan DNA siirtomaa sekvensointi. Lynx Therapeutics julkaistu ja markkinoidaan "massiivisesti rinnakkaisen allekirjoitus sekvensointi", tai multipolysakkaridisuspensiot, vuonna 2000. Tämä menetelmä sisällytetty parallelized, adapteri / ligaation välittämää helmi-pohjainen sekvensointitekniikan ja toimi ensimmäinen kaupallisesti saatavilla "seuraavan sukupolven" sekvensointimenetelmällä, vaikkei DNA sequenserit myytiin riippumattomien laboratorioiden. Vuonna 2004, 454 Life Sciences kaupan parallelized version pyrosekvensointi. Ensimmäinen versio heidän koneensa vähensi sekvensointi maksaa 6-kertainen verrattuna automatisoituja Sanger sekvensointia, ja oli toinen uuden sukupolven sekvensointiteknologioihin jälkeen multipolysakkaridisuspensiot.

Suuria määriä tietoja tuotettu DNA sekvensointi on myös tarpeen uusien menetelmien ja ohjelmia sekvenssianalyysillä. Phil Green ja Brent Ewing yliopiston Washington kuvasivat phred laatupisteet sekvensseritietoja analyysin vuonna 1998.

Perusmenetelmiä

Maxam-Gilbert-sekvensointi

Allan Maxam ja Walter Gilbert julkaisi DNA sekvensointi menetelmä vuonna 1977 perustuu kemiallinen muuntaminen DNA: n ja myöhempien pilkkominen tietyissä emäksiä. Joka tunnetaan myös nimellä kemiallisia sekvensointi, tämä menetelmä saa puhdistettua näytteitä kaksijuosteisen DNA: ta voidaan käyttää ilman kloonausta. Tämä menetelmä käytti radioaktiivinen leimaaminen ja sen tekninen monimutkaisuus lannistunut laajaan käyttöön sen jälkeen hienosäädöllä Sanger menetelmiä oli tehty.

Maxam-Gilbert-sekvensointi edellyttää radioaktiivinen leimaaminen on yksi 5 'päähän DNA: n ja puhdistus DNA-fragmenttia voidaan sekvensoida. Kemiallinen käsittely muodostaa sitten murtuu pieni osa yhden tai kaksi neljän nukleotidiemäksen kussakin neljässä reaktioita. Pitoisuus muuttaa kemikaalien ohjataan käyttöön keskimäärin yhden muutoksen kohti DNA-molekyyli. Siten sarja leimattujen fragmenttien syntyy, mistä radioaktiivisesti päästään ensimmäiseen "leikkaus" site kussakin molekyylissä. Fragmentit neljän reaktiot elektroforeesi vierekkäin denaturoivissa akryyliamidigeelejä koon erottamista. Visualisoida fragmentit, geeli altistetaan röntgenfilmille autoradiografiaa varten, jolloin saatiin sarja tummia raitoja, joista kukin vastaa radioleimattua DNA-fragmentti, josta sekvenssi voidaan päätellä.

Chain-lopetusmetodit

Ketju-irtisanominen kehittämä menetelmä Frederick Sanger ja työtoverit vuonna 1977 tuli pian paras menetelmä, koska sen suhteellinen helppous ja luotettavuus. Kun keksi, ketju-terminaattori menetelmä vähemmän myrkyllisiä kemikaaleja ja pienempiä määriä radioaktiivisuutta kuin Maxamin ja Gilbertin menetelmällä. Koska sen vertailevan helppous, Sanger menetelmä oli pian automatisoidun ja oli käytetty menetelmä ensimmäisen sukupolven DNA sekvenssereitä.

Sanger sekvensointi on menetelmä, joka vallitsi 80-luvulta asti 2000-luvun puolivälissä. Tänä aikana, suuria edistysaskeleita tehtiin tekniikalla, kuten loisteputki merkintöjä, kapillaarielektroforeesilla, ja yleinen automaatio. Tämä kehitys saa paljon tehokkaampaa sekvensointi, mikä alentaa kustannuksia. Sanger menetelmä, massatuotannossa muodossa, on tekniikka, joka tuotti ensimmäisen ihmisen genomin vuonna 2001, käynnistämään aikakaudella genomiikan. Kuitenkin myöhemmin vuosikymmenellä, radikaalisti erilaisia ​​lähestymistapoja tullut markkinoille, jolloin hinta per genomin alas $ 100 miljoonaa euroa vuonna 2001 $ 10.000 vuonna 2011.

Kehittyneitä menetelmiä ja de novo sekvensointi

Laajamittainen sekvensointi usein pyritään sekvensoimalla hyvin pitkä DNA-kappaleita, kuten kokonaisista kromosomeista, vaikka suuren mittakaavan sekvensointi voidaan myös käyttää tuottamaan erittäin suuria määriä lyhyitä sekvenssejä, kuten todettu faaginäyttö. Pidempään tavoitteita kuten kromosomit, yhteisiä lähestymistapoja muodostuvat leikkaamalla tai leikkaus suuria DNA-fragmenttien lyhyemmiksi DNA-fragmentteja. Fragmentoitunutta DNA: ta voidaan sitten kloonata DNA-vektoriin ja monistettiin bakteeri-isännän, kuten Escherichia coli. Lyhyt DNA-fragmentit puhdistettiin yksittäisistä pesäkettä ei ole erikseen sekvensoidaan ja kootaan elektronisesti yhdeksi pitkä, yhtenäinen järjestyksessä. Tutkimukset ovat osoittaneet, että lisäämällä koko valikoima askel kerätä DNA-fragmentteja tasakokoisia voi parantaa sekvensointi tehokkuutta ja tarkkuutta genomin kokoonpano. Näissä tutkimuksissa automatisoitu mitoitus on osoittautunut enemmän toistettavissa ja tarkka kuin manuaalinen geeli mitoitus.

Termi "de novo sekvensointi" viittaa erityisesti menetelmiä käytetään määrittämään sekvenssin DNA: n, jolla ei ole aiemmin tunnetun sekvenssin. De novo kääntää latinaksi "alusta". Puutteet kootussa järjestyksessä voidaan täyttää alukekävelyllä. Erilaisia ​​strategioita on erilaisia ​​kompromisseja nopeuden ja tarkkuuden; haulikko menetelmiä käytetään usein sekvenssoimalla suuri genomien, mutta sen kokoonpano on monimutkainen ja vaikea, erityisesti jakso toistuu usein aiheuttaa aukkoja genomin kokoonpano.

Useimmat sekvensointi lähestymistavat käyttää in vitro kloonausvaihe monistaa yksittäisiä DNA-molekyylejä, koska niiden molekyylien osoittamista menetelmät eivät ole riittävän herkkiä yhden molekyylin sekvensoinnilla. Emulsio PCR eristää yksittäisiä DNA-molekyylejä yhdessä pohjamaalilla-päällystetyillä helmillä vesipisaroita sisällä öljyfaasin. Polymeraasiketjureaktio sitten takit kunkin helmen kanssa klonaalinen kopiota DNA-molekyylin jälkeen liikkumattomuudesta myöhempää sekvensointia. Emulsio PCR: ää käytetään kehittämien menetelmien Marguilis et ai., Shendure ja Porreca et ai. ja Solid sekvensointi ,.

Haulikko sekvensointi

Haulikko sekvensointi on sekvensointimenetelmällä suunniteltu analysoimaan DNA-sekvenssien pidempi kuin 1000 emäsparia, enintään koko kromosomeja. Tämä menetelmä edellyttää kohde-DNA on jaettu satunnainen fragmentteja. Jälkeen sekvensointi yksittäisiä fragmentteja, sekvenssit voidaan koota uudelleen sen perusteella, niiden päällekkäisten alueiden.

Silta PCR

Toinen menetelmä in vitro klonaalisen monistuksen on silta PCR, jossa fragmentit monistetaan kun alukkeet on kiinnitetty kiinteään pintaan ja muodostavat "DNA: n pesäkkeitä" tai "DNA: n klustereita". Tätä menetelmää käytetään Illumina Genome Analyzer sekvenssereitä. Yhden molekyylin menetelmiä, kuten kehittämä Stephen Quake laboratoriossa ovat poikkeus: he käyttävät kirkas fluoroforit ja laser heräte havaita emäsadditio- tapahtumia yksittäisistä DNA-molekyylejä kiinnitetty pintaan, poistaa tarpeen molekyyli vahvistusta.

Seuraavan sukupolven menetelmiä

Seuraavan sukupolven sekvensointi koskee Genomikartoituksen, genomin uudelleensekvensointipuskuriin, transcriptome profilointi DNA-proteiini vuorovaikutusten, ja epigenome luonnehdinta. Järjestelytaulukkoon on tarpeen, koska genomin yhden ainoan yksittäisen lajin ei ilmaise koko genomin vaihteluita muun yksilöiden saman lajin.

Suuri kysyntä edullisen sekvensointi on ajanut kehitystä suurikapasiteettisten sekvensointiteknologioihin että yhdensuuntaistettua sekvensointi prosessi, tuottaa tuhansia tai miljoonia sekvenssien samanaikaisesti. Suurikapasiteettisten sekvensointiteknologioihin on tarkoitus alentaa DNA: n sekvensointi sitä, mikä on mahdollista standardin väriaine-terminaattori menetelmiä. Ultra-high-throughput sekvensointi peräti 500000 sekvensointi-synteesin toimintoja voidaan ajaa rinnakkain.

Massiivisesti rinnakkaisen allekirjoitus sekvensointi

Ensimmäinen seuraavan sukupolven sekvensointiteknologioihin, massiivisesti rinnakkaisen allekirjoitus sekvensointi, kehitettiin 1990-luvulla on Lynx Therapeutics, yritys perustettiin vuonna 1992 Sydney Brenner ja Sam Eletr. Multipolysakkaridisuspensiot oli helmi-perustuva menetelmä, joka käyttää monimutkaista lähestymistapaa sovittimen ligaation jälkeen sovitin koodauksen, lukeminen sekvenssi välein neljän nukleotidin. Tämä menetelmä teki alttiita sekvenssispesifisiä bias tai menetys spesifisiä sekvenssejä. Koska tekniikka oli niin monimutkainen, multipolysakkaridisuspensiot oli vain suoritettiin "in-house" Lynx Therapeutics eikä DNA-sekvensointia koneita myytiin riippumattomille laboratorioissa. Lynx Therapeutics sulautui Solexa vuonna 2004, mikä kehittämiseen sekvensointi-synteesin, yksinkertaisempi lähestymistapa hankitaan Manteia Ennakoiva Medicine, joka teki multipolysakkaridisuspensiot vanhentunut. Kuitenkin olennaiset ominaisuudet multipolysakkaridisuspensiot tuotoksen olivat tyypillisiä myöhemmin "seuraavan sukupolven" tietotyypit, mukaan lukien satoja tuhansia lyhyitä DNA-sekvenssejä. Kun kyseessä on multipolysakkaridisuspensiot, nämä olivat tyypillisesti käytetään sekvensoimiseksi cDNA mittauksia geenin ilmentymisen tasoa.

Polony sekvensointi

Polony sekvensointi menetelmä, kehitetty laboratoriossa George M. kirkon Harvardin, oli ensimmäisiä seuraavan sukupolven sekvensointi järjestelmiä ja käytettiin sekvenssoimiseksi koko genomin vuonna 2005. Se yhdistää in vitro pariksi-tag kirjasto emulsio PCR, automatisoitu mikroskooppi, ja ligaation perustuva sekvensointi kemia sekvensoida E. coli genomiin tarkkuus & gt; 99,9999%, ja kustannus on noin 1/9, että Sanger-sekvensoinnilla. Teknologia lisensoitu Agencourt biotieteiden, sittemmin kehrätty ulos Agencourt Henkilökohtaiset Genomiikka, ja lopulta sisällytetty Applied Biosystems vankan pohjan, joka omistaa nykyisin Life Technologies, joka äskettäin osti Thermo Fisher Scientific.

454 pyrosekvensointi

Parallelized versio pyrosekvensointi kehitti 454 Life Sciences, joka on sittemmin hankkinut Roche Diagnostics. Menetelmä monistaa DNA-sisälle vesipisaroiden öljyn liuokseen, jossa kukin pisara sisältää yhden DNA-templaatin kiinnitetty yhden alukkeen päällystetty helmi, joka muodostaa sitten klonaalinen pesäke. Sekvensointi Kone sisältää monia pikolitran-tilavuus kuoppiin kukin sisältää yhden helmi ja sekvensoimalla entsyymejä. Pyrosekvensointi käyttää lusiferaasi tuottaa valoa havaitsemiseen yksittäisten nukleotidien lisätty syntyvän DNA: n, ja yhdistetyn datan käytetään tuottamaan sekvenssi lukea-out. Tämä tekniikka tarjoaa väli Lue pituus ja hinta per pohja verrattuna Sanger sekvensointia toisessa päässä ja Solexa ja kiinteät toisella.

Illumina sekvensointi

Solexa, nyt osa Illumina, perusti Shankar Balasubramanian ja David Klenerman vuonna 1998, ja kehitti sekvensointi perustuva menetelmä palautuvia väriaine-terminaattorit teknologiaa, ja suunniteltu polymeraaseja. Päättynyt kemia on kehitetty sisäisesti Solexa ja käsite Solexa järjestelmän keksi Balasubramanian ja Klenerman Cambridgen yliopiston kemian laitos. Vuonna 2004 Solexa osti yhtiön Manteia Ennakoiva Medicine saadakseen massivelly rinnakkaissekvensointijärjestelmät tekniikka perustuu "DNA Clusters", johon kuuluu klonaalisen monistaminen DNA pinnalla. Klusterointiteknologiaa oli mukana hankittu Lynx Therapeutics Kaliforniassa. Solexa Ltd myöhemmin sulautui Lynx muodostaen Solexa Inc.

Tässä menetelmässä DNA-molekyylejä ja alukkeita ensin kiinnitetty dia ja monistetaan polymeraasilla niin että paikalliset klonaalisen DNA siirtomaita, myöhemmin loi "DNA klustereita", muodostuu. Sekvenssin määrittämiseksi, neljä palautuvia terminaattorin emäksiä lisätään ja ei-sisällytetty nukleotidit pestään pois. Kamera ottaa kuvia fluoresoivasti leimattuja nukleotideja, niin väriaine, yhdessä päätteen 3 "esto, on kemiallisesti poistetaan DNA, joka mahdollistaa seuraavan syklin alkua. Toisin pyrosekvensointi, DNA ketjut laajennetaan yhden nukleotidin kerrallaan ja kuva hankinta voidaan suorittaa myöhässä hetkellä, mikä mahdollistaa erittäin suurten taulukoiden DNA pesäkkeiden vangiksi peräkkäisiä kuvia otettu yhdellä kameralla.

Irrottamista entsymaattisen reaktion ja kuvan ottamisen mahdollistaa optimaalisen suoritusteho ja teoreettisesti rajaton sekvensointi kapasiteetti. Kanssa optimaalista, lopulta tavoitettavissa instrumentti läpijuoksu on siis riippuu ainoastaan ​​analogi-digitaali tulosprosentti kameran, kerrottuna kameroiden ja jaettuna pikseliä kohden DNA siirtomaa tarvitaan visualisointiin niitä optimaalisesti. Vuonna 2012, kameroiden toimivat yli 10 MHz / D muuntokurssit ja käytettävissä optiikka, mikrofluidiikka ja enzymatics, suoritusteho voi olla kerrannaisina 1000000 nukleotidin / sekunti, joka vastaa suunnilleen 1 Ihmisen genomin vastaava 1x kattavuus tunnissa kohti väline, ja 1 Ihmisen genomin uudelleen sekvensoitu per päivä per väline.

Solid sekvensointi

Applied Biosystems "vankka tekniikka työllistää sekvensointi ligaatiolla. Täällä, uima-allas kaikista mahdollisista oligonukleotidien kiinteän pituuden on merkitty mukaan sekvensoitu asentoon. Oligonukleotidit hybridisoitiin ja liitettiin; etuoikeutetut ligaatio DNA ligaasia vastaavat sekvenssit tuloksena signaalin informatiivinen nukleotidisekvenssin tuossa asemassa. Ennen sekvensointi, DNA monistetaan emulsio PCR: llä. Tuloksena helmiä, joista kukin sisältää yhden kopioita samasta DNA-molekyylin, on talletettu lasilevyllä. Tuloksena on sekvenssit määrät ja pituudet verrattavissa Illumina sekvensointi. Tämä sekvensointi liittämällä menetelmällä on raportoitu joitakin kysymys sekvensoimalla palindromisiin sekvenssit.

Ion Torrent puolijohde sekvensointi

Ion Torrent Systems Inc: n kehittämä järjestelmä, joka perustuu tavallisilla sekvensointia kemiaa, mutta romaani, puolijohde perustuva tunnistusjärjestelmä. Tämä menetelmä sekvensointi perustuu havaitsemiseen vetyioneja, joita vapautuu polymeroinnin aikana DNA: n, toisin kuin optisia menetelmiä, joita käytetään muiden sekvensointi järjestelmissä. Mikrokaivo, joka sisältää templaatti-DNA-juosteen voidaan sekvensoida tulvii yhden tyyppisen nukleotidin. Jos käyttöön nukleotidin täydentää johtava malli nukleotidin se sisällytetään kasvavaan komplementaarinen juoste. Tämä aiheuttaa vapauttaa vetyionin, joka laukaisee yliherkkä ioni-anturi, joka osoittaa, että reaktio on tapahtunut. Jos homopolymeeri toistot ovat läsnä templaattisekvenssistä useita nukleotidin sisällytetään yhden syklin. Tämä johtaa vastaava määrä vapautuu vetyjä ja suhteellisesti suurempi sähköisen signaalin.

DNA nanoball sekvensointi

DNA-nanoball sekvensointi on eräänlainen suurikapasiteettisten sekvensointi teknologiaa käytetään määrittämään koko genomisen sekvenssin organismin. Yhtiö Complete Genomics käyttää tätä tekniikkaa sekvenssin näytteet riippumattomien tutkijoiden. Menetelmässä käytetään liikkuvan ympyrän replikointi monistaa pieniä palasia genomisen DNA DNA: han nanoballs. Kahleeton sekvensointi liittämällä käytetään sitten nukleotidisekvenssin määrittämiseksi. Tämä menetelmä DNA sekvensointi mahdollistaa paljon DNA nanoballs ratkaistava asteittain kohti ajaa ja alhaisen reagenssin kustannukset verrattuna muihin seuraavan sukupolven sekvensointi alustoilla. Kuitenkin vain lyhyt sekvenssejä DNA määritetään kustakin DNA nanoball mikä tekee kartoituksen lyhyt lukee viite genomin vaikea. Tämä tekniikka on käytetty useita Genomikartoituksen hankkeita ja on tarkoitus käyttää enemmän.

Heliscope yksittäinen molekyyli sekvensointi

Heliscope sekvensointi on menetelmä yhden molekyylin sekvensoinnilla kehittämä Helicos Biosciences. Se käyttää DNA-fragmentit, joihin on lisätty poly-A-hännän sovittimia, jotka on liitetty virtauksen solun pintaan. Projektin seuraavat vaiheet laajentaminen perustuva sekvensointi syklisten pesee virtauskennon fluoresoivasti leimattuja nukleotideja. Lukee suoritetaan Heliscope sekvensserillä. Lukee ovat lyhyitä, jopa 55 emästä kohti aikavälillä, mutta viimeaikaiset parannukset mahdollistavat tarkemman lukee venyy yhdenlaista nukleotidin.

Tämän sekvensointi menetelmä ja laitteita käytettiin sekvensoimaan genomiin M13-bakteriofagin.

Yksi molekyyli reaaliaikainen sekvensointi

SMRT sekvensointi perustuu sekvensointi synteettisesti lähestymistapaa. DNA syntetisoitiin nolla-tilassa aalto-oppaita - pieni hyvin kuten säiliöt syömällä työkalut sijaitsevat alareunassa hyvin. Sekvensointi suoritetaan käyttämällä modifioimattoman polymeraasin ja fluoresoivasti leimattua nukleotidia virtaa vapaasti liuoksessa. Kuopat on muodostettu siten, että vain fluoresenssin tapahtuvaa pohjaan hyvin havaitaan. Fluoresenssileima irrotetaan nukleotidin kun sen sisällyttäminen DNA Strand, jättäen modifioimatonta DNA-juosteen. Mukaan Tyynenmeren biotieteiden SMRT kehittäjä, menetelmä mahdollistaa havaitsemisen nukleotidin muutoksia. Tämä tapahtuu havainto polymeraasin kinetiikkaa. Tämä lähestymistapa mahdollistaa lukee 20000 nukleotidin tai enemmän, keskimäärin lukea pituus 5 kiloemästä.

Menetelmiä kehitys

DNA: n sekvensointi menetelmiä kehitetään parhaillaan sisällä merkintää DNA-polymeraasia, lukeminen sekvenssin DNA-säikeen kauttakulkua nanohuokosiin, ja mikroskopia-tekniikat, kuten atomivoimamikroskopialla tai läpäisyelektronimikroskoopilla, joita käytetään tunnistamaan kannat yksittäisten nukleotidin sisällä pitkä DNA-fragmenttien nukleotidisekvenssi leimausta raskaampia elementtejä visuaalinen tunnistus ja tallennus. Kolmannen sukupolven teknologiat pyritään lisäämään läpijuoksu ja vähentää aikaa johtavan ja kustannuksia poistamalla tarpeen liiallisen reagenssien ja hyödyntämällä prosessiivisuus DNA-polymeraasin.

Nano- DNA-sekvensointi

Tämä menetelmä perustuu lukema sähköisten signaalien esiintyvät nukleotideissa ohi alfa-hemolysiinia huokoset kovalenttisesti sidottu syklodekstriinin. DNA läpi nano- muuttaa ionivirran. Tämä muutos on riippuvainen muoto, koko ja pituus DNA-sekvenssin. Kunkin nukleotidin estää ionivirtauksen huokosen läpi ja eri ajan. Menetelmä on potentiaalia kehityksen, koska se ei vaadi muokattuja nukleotideja, mutta yhden nukleotidin resoluutio ei ole vielä saatavilla.

Kaksi tärkeintä nano- sekvensointi kehityksessä ovat Solid State nano- sekvensointi, ja proteiini perustuvat nano- sekvensointi. Proteiini nano- sekvensointi hyödyntää membraaniproteiini komplekseja α-hemolysiinia ja MSPA, jotka osoittavat suuri lupaus annetaan niiden kykyä erottaa yksittäisten ja ryhmien nukleotidien. Ottaa huomioon, solid-state-nano- sekvensointi käytetään synteettisiä materiaaleja, kuten piinitridiä ja alumiinioksidia, ja se on edullista sen erinomainen mekaaninen kyky ja lämpö- ja kemiallisen stabiilisuuden. Valmistusmenetelmä on tärkeää tämän tyyppisen sekvensointi koska nano- joukko voi sisältää satoja huokosia, joiden halkaisijat ovat pienempiä kuin kahdeksan nanometriä.

Käsite alkunsa siitä ajatuksesta, että yksijuosteisen DNA: n tai RNA-molekyylejä voidaan elektroforeettisesti ajaa tiukasti lineaarisesti läpi biologisen huokosen, joka voi olla pienempi kuin kahdeksan nanometriä, ja voidaan havaita, koska molekyylit vapauttavat ionivirran liikuttaessa läpi huokosten. Huokosten sisältää havaitseminen alue, joka pystyy tunnistamaan eri emäksiä, jossa kukin tukiasema tuottaa eri aikaan erityisiä signaaleja, jotka vastaavat sekvenssin emästen, kun ne ylittävät huokosten, jotka sitten arvioidaan. Kun Prosessin täytäntöönpanossa on tärkeää huomata, että ohjaus on tarkkaa DNA liikenteen läpi pore on ratkaisevan tärkeää onnistumisen. Erilaiset entsyymit, kuten eksonukleaaseja ja polymeraaseja on käytetty valvoa tätä prosessia sijoittamalla ne lähellä huokosten sisäänkäynti.

Tunnelinlouhintakoneet virtaukset DNA-sekvensointi

Toinen lähestymistapa käyttää mittaukset sähkö- tunneloinnin virrat poikki yksiketjuisen DNA: koska se liikkuu kautta kanava. Riippuen sen sähköinen rakenne kunkin tukiaseman vaikuttaa tunnelointivirran eri tavalla, jolloin erotella eri perustein.

Käyttö tunnelointi virtaukset on mahdollista sekvensoida kertaluokkia nopeammin kuin ionivirran menetelmät ja sekvensointi useista DNA oligomeerejä ja mikro-RNA on jo saavutettu.

Sekvensointi hybridisoimalla

Sekvensointi hybridisaatiolla on ei-entsymaattinen menetelmä, jossa käytetään DNA-siru. Yksi allas DNA, jonka sekvenssi on määritettävä on fluoresoivasti leimattu, ja hybridisoitiin joukko, jotka sisältävät tunnettuja sekvenssejä. Vahva hybridisaatiosignaaleja tietystä paikalla array tunnistaa sen sekvenssi DNA sekvensoitiin.

Tämä menetelmä sekvensointi käytetään sitovia ominaisuuksia kirjaston lyhyt yksijuosteinen DNA-molekyylejä, joita kutsutaan myös DNA-koettimia rekonstruoida kohde-DNA-sekvenssin. Ei-spesifinen hybridit poistetaan pesemällä, ja kohde-DNA eluoidaan. Hybridit järjestetään uudelleen siten, että DNA-sekvenssi voidaan rekonstruoida. Hyöty sekvensointi tyyppi on sen kyky vangita useita tavoitteita homogeeninen kattavuus. Vaikka suuri määrä kemikaaleja ja lähtö-DNA on yleensä tarvita. Mutta, kynnyksellä ratkaisun perustuvan hybridisaation paljon vähemmän laitteet ja kemikaalit ovat tarpeen.

Sekvensointi massaspektrometrialla

Massaspektrometriaa voidaan käyttää määrittämään DNA-sekvenssejä. Matrix-laserdesorptio ionisaatio-lentoaika-massaspektrometrialla, tai MALDI-TOF-MS:, on erityisesti tutkittu vaihtoehtoinen menetelmä geelielektroforeesi visualisointiin DNA-fragmenttien. Tämän menetelmän, DNA-fragmenteista, jotka syntyvät ketjun päättymisen sekvensointireaktiot verrataan massa pikemminkin kuin koko. Massa kutakin nukleotidia on erilainen kuin muut, ja tämä ero on havaittavissa massaspektrometrialla. Yhden nukleotidin mutaatiot fragmentti voidaan helpommin havaita MS kuin geelielektroforeesilla yksin. MALDI-TOF-MS voi helpommin havaita eroja RNA-fragmentit, joten tutkijat voivat epäsuorasti sekvenssin DNA-MS-menetelmiä muuttamalla se RNA ensin.

Tarkempaa DNA-fragmenttien sallittu MS-menetelmiä on erityisen kiinnostavaa tutkijoille rikosteknisen tutkimuksen, koska ne saattavat haluta löytää yhden nukleotidin polymorfismien ihmisen DNA-näytteet yksilöiden tunnistamiseksi. Nämä näytteet voidaan erittäin hajota niin rikosteknisen tutkijat mieluummin Mitoochondrial DNA sen suurempi vakaus ja sovelluksia linjaa tutkimuksia. MS-pohjainen sekvensointi menetelmiä on käytetty verrata sekvenssit ihmisen mitokondrioiden DNA näytteet Federal Bureau of Investigation tietokannan ja luista löydetty joukkohaudoista maailmansodan sotilaita.

Varhainen ketjun päättymisen ja TOF MS-menetelmien osoitettiin lukea pituudet jopa 100 emäsparia. Tutkijat eivät ole pystyneet ylittää tämän keskimääräisen Lue koko; kuten ketjun päättymisen sekvensointi yksin, MS-pohjainen DNA sekvensointi ei ehkä sovi suurille de novo sekvensointi hankkeita. Jopa niin, tuoreessa tutkimuksessa käyttivät lyhyen sekvenssin lukee ja massaspektroskopialla verrata yhden nukleotidin polymorfismien patogeenisten Streptococcus.

Mikrokanava Sanger sekvensointi

Mikrofluidistisissa Sanger sekvensoimalla koko termosyklisointireaktio monistamisen DNA-fragmenttien sekä niiden erottaminen elektroforeesilla tehdään yhdessä lasikiekkoon mikä vähentää reagenssin käyttöä sekä kustannuksia. Joissakin tapauksissa tutkijat ovat osoittaneet, että ne voivat lisätä läpijuoksu tavanomaisten sekvensoinnin avulla mikrosirujen. Tutkimuksessa on vielä tehtävä, jotta tämän teknologian käyttöön tehokas.

Mikroskopia-tekniikat

Tämä lähestymistapa suoraan visualisoi sekvenssin DNA-molekyylien avulla elektronimikroskoopilla. Ensimmäinen tunnistaminen DNA emäsparia sisällä ehjät DNA-molekyylit entsymaattisesti a sisältävien modifioituja emäksiä, jotka sisältävät atomit kasvoi atomiluvun, suora visualisointi ja tunnistaminen yksittäin merkittävä tukikohtaa synteettinen 3272 emäsparin DNA-molekyylin ja 7249 emäsparin virusgenomia on osoitettu.

RNAP sekvensointi

Tämä menetelmä perustuu käyttöön RNA-polymeraasin, joka on kiinnitetty polystyreenihelmeä. Toinen pää DNA: n sekvenssi on liitettävä toiseen helmi, sekä helmiä on sijoitettu optinen ansoja. RNAP liikkeen aikana transkription tuo helmet läheisempään ja niiden suhteellinen etäisyys muutoksia, jotka voidaan sitten kirjata yhden nukleotidin päätöslauselman. Sekvenssi päätellään perustuu neljään lukemat madallettu pitoisuuksia kunkin neljän nukleotidin tyyppejä, samalla Sangerin menetelmää.

RNA-polymeraasi on kiinnitetty toiseen päähän polystyreenihelmeä ja toinen pää on kiinnitetty sen distaaliseen päähän DNA-fragmentin. Jokainen helmi on sitten juuttunut optiseen ansaan joka leijuu helmiä. Vuorovaikutusta RNAP ja DNA: n tuloksen muutokseen DNA: n pituus kahden helmiä. Tämä muutos on mitattu tarkasti tuloksena yhden emäksen päätöslauselman yhden DNA-molekyylin. Tämän jälkeen toistetaan neljä kertaa, jossa joka kerta on pienempi konsentraatio yksi neljästä nukleotidin, tämä jakaa jotkut samankaltaisuus alukkeita käytetään Sangerin Sequencing menetelmällä. Vertailu koskee alueiden ja sekvenssitietoa päätellään vertaamalla tunnetun sekvenssin alueita tuntematon sekvenssialueisiin.

In vitro virus suurikapasiteettisten sekvensointi

Menetelmä on kehitetty analysoida täysin erilaista proteiinivuorovaikutusten yhdistämällä 454 pyrosekvensointi ja in vitro virus mRNA näyttö menetelmä. Tarkemmin, tämä menetelmä kytkee kovalenttisesti kiinnostavia proteiineja ja mRNA: t, jotka koodaavat niitä, niin tunnistaa mRNA palaset käyttäen käänteistranskription PCR. MRNA voidaan sitten monistaa ja sekvensoitiin. Yhdistetyn menetelmän on nimeltään IVV-HiTSeq ja voidaan suorittaa soluvapaassa olosuhteissa, vaikka sen tulokset eivät välttämättä ole edustava in vivo olosuhteissa.

Kehitysaloitteita

Lokakuussa 2006 X Prize Foundation perustettiin aloitetta edistää koko Genomikartoituksen teknologioita, nimeltään Arkontti X Prize, jotka aikovat tehdä $ 10 miljoonaa "ensimmäinen joukkue, joka voi rakentaa laitteen ja käyttää sitä sekvensoimiseksi 100 ihmisen genomit 10 päivää tai vähemmän, joiden tarkkuus on enintään yksi virhe jokaisessa 100000 emäkset sekvensoitiin, jossa sekvenssit tarkasti kattavat vähintään 98% genomin, ja toistuva kustannukset korkeintaan $ 10,000 per genomin. "

Vuosittain National Human Genome Research Institute, tai NHGRI, edistää apurahoja uutta tutkimusta ja kehitystä genomiikan. 2010 avustukset ja 2011 ehdokkaita ovat jatkuvaa työtä mikrofluidinen, polony ja pohja-raskas sekvensointi menetelmiä.

Laskennallisia haasteita

Sekvensointiteknologioihin Tässä kuvattu tuottaa raakadataa, joka on koota pidempiä sekvenssejä kuten täydellinen genomeja. On olemassa monia laskennallisia haasteita tämän saavuttamiseksi, kuten arviointi raaka-sekvenssin tietoja, jotka on tehty ohjelmien ja algoritmeja, kuten Phred ja Phrap. Muita haasteita on käsiteltävä toistuvat sekvenssit, jotka usein estävät täydellinen genomin kokoonpanot koska ne esiintyvät monin paikoin genomin. Tämän seurauksena monet sekvenssit ei voi kohdistaa tiettyihin kromosomeihin. Raaka sekvenssidataan on vasta alkua sen yksityiskohtaisen bioinformatical analyysi. Silti uusia menetelmiä sekvensointi ja korjaamiseksi sekvensointivirheitä kehitettiin.

Lue trimmaus

Joskus, raaka lukee tuottamat sekvensserillä ovat oikeita ja tarkkoja vain murto niiden pituudesta. Käyttämällä koko luku voi esitellä artefakteja loppupään analyysien kuten genomin kokoonpano, SNP kutsuvan, tai geenin ilmentyminen arvio. Kaksi luokkaa leikkaus ohjelmia on otettu käyttöön, perustuu ikkuna-pohjainen tai käynnistysvaiheen summa luokkien algoritmeja. Tämä on osittainen luettelo trimmausta algoritmien tällä hetkellä saatavilla, täsmennetään algoritmi luokka ne kuuluvat:

  • Cutadapt Running summa
  • ConDeTri Ikkunaperusteinen
  • ERNE-suodatin käytössä summa
  • FASTX laatu trimmeri Ikkunaperusteinen
  • PRINSEQ Ikkunaperusteinen
  • Trimmomatic Ikkunaperusteinen
  • SolexaQA Ikkunaperusteinen
  • SolexaQA-BWA Running summa
  • Sirppi Ikkunaperusteinen
  0   0
Edellinen artikkeli Mohamed Moumou
Seuraava artikkeli Hannibal

Aiheeseen Liittyvät Artikkelit

Kommentit - 0

Ei kommentteja

Lisääkommentti

smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile
Merkkiä jäljellä: 3000
captcha